題目：甘草的抗結(jié)直腸癌作用及其通過HPLC整合和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的潛在機(jī)制

英文名：Anti-colorectal cancer actions of Glycyrrhiza uralensis Fisch. and its underlying mechanism via HPLC integration and network pharmacological approaches

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7

發(fā)表時(shí)間：2025年1月6日

研究背景：結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)病率和死亡率高，現(xiàn)有治療手段副作用顯著。甘草在抗癌中具潛力，但其抗CRC的關(guān)鍵活性成分及機(jī)制尚不明確，亟需系統(tǒng)研究。

研究思路：本研究先通過HPLC鑒定甘草中的活性成分，再利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選潛在靶點(diǎn)并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，最后通過SW480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（增殖、遷移、侵襲等）和裸鼠異種移植模型實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證主要成分甘草苷（甘草苷）的抗CRC作用及機(jī)制。

研究結(jié)果：

1、甘草提取物中活性成分分析

基于前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)，對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品和制備的甘草提取物進(jìn)行HPLC分析。HPLC結(jié)果如圖1A和B所示。通過樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較，檢測到7種化合物：蘆?。▓D1C）、甘草查爾酮A（圖1D）、甘草酸（圖1E）、異甘草苷（圖1F）、甘草素（圖1G）、異甘草苷芹糖基（圖1H）和甘草苷（圖1I）。

圖1

2、甘草主要活性成分治療CRC的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

從GeneCards數(shù)據(jù)庫收集CRC（疾?。┫嚓P(guān)靶點(diǎn)，鑒定出322個(gè)與藥物靶點(diǎn)相交的靶點(diǎn)（圖2A）。如圖2B所示，較大和較暗的節(jié)點(diǎn)表示可能與CRC關(guān)聯(lián)更密切的靶點(diǎn)，鑒定出的靶點(diǎn)包括TP53、SRC、STAT3和PIK-3CA，成為前四個(gè)核心靶點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)代表了甘草活性成分抗CRC的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在其治療效果中起核心作用。對七種活性成分治療CRC的基因本體（GO）功能富集分析產(chǎn)生了1,285個(gè)GO術(shù)語（P<0.05），包括860個(gè)生物過程（BP）術(shù)語，涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控和細(xì)胞增殖正調(diào)控、炎癥反應(yīng)和蛋白質(zhì)自磷酸化等（圖2C）。在DAVID數(shù)據(jù)庫中對七種活性成分與CRC的322個(gè)相交靶點(diǎn)進(jìn)行分析，鑒定出177條KEGG通路，這些通路在CRC治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)中富集（圖2D）。KEGG通路分析后，將通路中鑒定的靶點(diǎn)映射到其相應(yīng)的化合物，并使用Cytoscape（3.7.2）構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)由279個(gè)節(jié)點(diǎn)和1,238條邊組成，包括7個(gè)活性成分、252個(gè)靶點(diǎn)和20條信號通路（圖2E）。這表明甘草的活性成分可以通過多種化合物和靶點(diǎn)作用于多個(gè)通路，共同促成治療CRC的效果。

圖2

3、分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

對接能值<-4.25kcal/mol（1cal≈4.186J）通常是可接受的，表明分子之間有結(jié)合活性，而<-5.0kcal/mol和<-7.0kcal/mol分別表示良好和強(qiáng)結(jié)合活性。核心靶點(diǎn)基因與核心成分之間的結(jié)合能如圖3B所示。在這些成分中，甘草酸表現(xiàn)出最強(qiáng)的結(jié)合能力，甘草苷排名第二。這兩種活性成分與TP53、SRC、STAT3和PIK3CA蛋白的分子對接結(jié)果如圖3A所示。如圖3C所示，甘草苷-TP53復(fù)合體系在40ns后達(dá)到平衡，RMSD波動(dòng)穩(wěn)定在約2.2?左右，表明配體與靶蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性高。進(jìn)一步分析顯示，模擬過程中回轉(zhuǎn)半徑（Rg）和溶劑可及表面積（SASA）的波動(dòng)較?。▓D3D和E），表明配體結(jié)合后蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。氫鍵在配體-蛋白質(zhì)相互作用中起關(guān)鍵作用。如圖3F所示，配體與蛋白質(zhì)之間的氫鍵數(shù)量在0到4之間，平均約3個(gè)鍵，表明存在強(qiáng)氫鍵相互作用。均方根波動(dòng)（RMSF）用于評估蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的靈活性。如圖3G所示，RMSF值相對較低（大多低于3?），表明靈活性降低，穩(wěn)定性增加?？傊?，甘草苷-TP53復(fù)合體系表現(xiàn)出高結(jié)合穩(wěn)定性和強(qiáng)氫鍵相互作用，表明甘草苷與TP53的有效結(jié)合。

圖3

4、體外實(shí)驗(yàn)

HPLC、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接數(shù)據(jù)結(jié)果表明，甘草中的甘草苷和甘草酸均對CRC表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。因此，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以比較它們對CRC的抑制能力。如圖4A和B所示，將不同濃度（μM）的甘草苷（25、50、100、200和400）應(yīng)用于SW480細(xì)胞24和48小時(shí)，導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞活力抑制，結(jié)果顯示，甘草苷以劑量依賴性方式抑制SW480細(xì)胞的增殖，而甘草次酸則不然。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇50、100和200μM的甘草苷濃度進(jìn)行48小時(shí)處理。集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4C和D所示，與對照組相比，甘草苷組形成的細(xì)胞集落數(shù)量顯著減少。同樣，奧沙利鉑組的細(xì)胞集落數(shù)量也減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。用甘草苷（50、100、200μMol/L）處理SW480細(xì)胞48小時(shí)后，結(jié)果顯示，與對照組相比，甘草苷以劑量依賴性方式促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡，如圖4E所示。

圖4

5、甘草苷抑制SW480劃痕、遷移和入侵實(shí)驗(yàn)

與對照組相比，陽性藥物組的細(xì)胞遷移率和遷移細(xì)胞數(shù)量減少，如圖5a和B所示，劃痕區(qū)域愈合明顯受到抑制，細(xì)胞遷移減慢。在藥物處理組（48小時(shí)），50-200μM濃度顯著抑制SW480細(xì)胞的遷移，表明甘草苷有效降低細(xì)胞的遷移能力，效果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）且呈濃度依賴性。使用Transwell方法評估甘草苷對SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，如圖5C-F所示，結(jié)果顯示，處理48小時(shí)后，與對照組相比，陽性對照組的遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在200μM濃度的甘草苷組中，與對照組相比，細(xì)胞遷移和侵襲均減少，變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明甘草苷有效減弱SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力。使用westernblot分析SW480細(xì)胞中侵襲蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著甘草苷濃度的增加，蛋白質(zhì)水平顯著下降。在200μM以及陽性對照組中，MMP蛋白（-1、-3和-9）的表達(dá)被顯著抑制，此外，在100μM時(shí)，MMP-1的表達(dá)也顯著降低（圖5G-J），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。研究結(jié)果表明，甘草苷可有效阻礙侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而降低SW480細(xì)胞的侵襲潛力。

圖5

6、甘草苷對裸鼠SW480異種移植模型狀態(tài)和腫瘤大小的影響

在BALB/c裸鼠接種SW480細(xì)胞后的第3至4天，在右腋窩檢測到可觸及的實(shí)體瘤，然后在腫瘤植入后的第7天開始腹腔注射甘草苷，并持續(xù)12天。在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組和治療組的裸鼠均未死亡。腫瘤建模成功后，兩組均表現(xiàn)出正常的飲食和活動(dòng)，體重?zé)o明顯變化。在治療期間，甘草苷治療組的整體狀況優(yōu)于模型組，各組之間體重?zé)o顯著差異，且這些差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A和B），表明甘草苷在體內(nèi)給藥是安全的。處死小鼠后，切除腫瘤并稱重。如圖6C和D所示，與模型組相比，甘草苷治療組的腫瘤重量顯著降低（P<0.05），且這種降低呈劑量依賴性，從而表明甘草苷對裸鼠SW480異種移植物的生長具有抑制作用。

圖6

7、甘草苷對裸鼠SW480異種移植腫瘤組織中p53/p38MAPK通路表達(dá)水平的影響

基于PPI網(wǎng)絡(luò)、分子對接和KEGG通路分析，推測甘草苷可能通過靶向p53來調(diào)節(jié)MAPK信號傳導(dǎo)，western blot結(jié)果顯示，100和200μM甘草苷治療組的p-p53/p53水平顯著高于模型組（P<0.01），而任何濃度的p-p38MAPK/p38MAPK均顯著降低（P<0.01）（如圖7A和C所示）。HE染色結(jié)果證實(shí)，模型組的腫瘤組織表現(xiàn)出細(xì)胞彌漫性生長，細(xì)胞排列緊密，形態(tài)基本完整（如圖7D所示）。這些發(fā)現(xiàn)表明，甘草苷導(dǎo)致裸鼠SW480異種移植組織發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)變化。因此，研究結(jié)果證實(shí)，甘草苷可能通過p53/p38MAPK信號軸抑制裸鼠SW480異種移植物的生長。

圖7

總結(jié)：研究證實(shí)甘草中的甘草苷通過靶向p53并抑制p38MAPK通路，顯著抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及裸鼠腫瘤生長，為甘草治療CRC提供了藥理基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！