用標記的特異性抗體，對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量，進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。
本實驗是將組織細胞內的抗原可視化過程，可直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上原位顯示某些蛋白質或多肽類物質，并可精確到亞細胞結構水平。載玻片上的組織細胞經過預處理（脫蠟至水、抗原修復等）后，孵育相應的抗體，此時抗原（多肽、蛋白質、外源性物質等）被第一抗體特異性識別結合，然后把第一抗體作為抗原繼續(xù)通過第二抗體特異性識別結合（第二抗體上有標記特定物質），若第二抗體標記的特定物質為辣根過氧化物酶（HRP），可與DAB在特定條件下反應形成棕褐色沉淀，最后通過顯微鏡觀察。
免疫組織化學技術可借助顯微鏡的顯像與放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、酶、激素、病原體及受體等）。在病理學中，免疫組化技術常用來進行腫瘤的診斷及鑒別診斷，也可通過此技術對腫瘤進行更細化的分類。
根據(jù)抗原抗體反應（即抗原抗體特異性結合）和化學顯色原理，引入附有標記物的外源性抗體（或抗原），使之錨定于組織或細胞標本中相應的抗原（或抗體），標記物經呈色反應來顯示待檢抗原（或抗體）。
脫蠟與水化-抗原修復-滅活內源性過氧化物酶和生物素-血清封閉-孵育一抗-孵育二抗-DAB顯色-蘇木素復染-脫水與透明-封片-顯微鏡鏡檢。
1、提供固定合格的樣本。組織離體后，選擇合適的固定液立即固定，固定液的量建議大于組織體積的10-15倍，新鮮標本用合適的容器固定24-48h，大標本固定12h，再切開固定。標本常溫（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷凍結冰，固定樣本常溫運輸送樣。
2、涂片和爬片必須充分固定，石蠟切片實驗前需充分脫蠟。
3、提供準確的抗體信息。
實驗結果:
免疫組化常見問題解答:
1）產生組織切片非特異性染色的原因有哪些？ 如何解決？
1 、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是 最重要的一條。
2 、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加 滅活劑濃度來降低背景染色；
4 、 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；
5 、 DAB 孵育時間過長或濃度過高；
6 、 PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色， 在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤為重要；
7 、 標本染色過程中經常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。
2）免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些？
1、抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結果，抗原抗體反應有前帶和 后帶效應， 必須摸索最佳濃度。
2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合； 建議微波修復 用高火 4 次*6min 試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行， 還可高壓修復。
3、組織切片本身這種抗原含量低。
4 、血清封閉時間過長。
5 、DAB 孵育時間過短。
6 、細胞通透不全， 抗體未能充分進入胞內參與反應。
7、開始做免疫組化，建議一定要首先做個陽性對照片， 排除抗體等問題。
3）石蠟切片和冰凍切片的比較？
1 、要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片。因為做石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織 的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
2 、冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易 形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時， 目 錄上都寫著做什么樣的切片， 如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。
3 、石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80 度的 低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止 RNA 降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右， 所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
4）如何選擇一抗？
1 、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一 的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由 好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特 異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低； 而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高， 但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。
2 、應用范圍的選擇。有的一抗只能用于 Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標明石蠟切 片或冰凍切片。
3 、種屬反應性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測 哪種種屬動物體內的抗原。
4 、種屬來源，一般兔來源的多是多克隆抗體；而小鼠來源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相 應的二抗。
5 、生產廠家的選擇。
5）在什么情況下使用 TritonX-100？
1 、Triton X-100 化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(>10um 厚切片) 和免疫細胞化學 中一般用 Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
2 、其作用原理： Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞 漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。
3 、Triton X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
6）封閉血清的選擇原則是什么？
1 、膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體， 造成后續(xù)結果的假陽性。
2 、封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體， 預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合， 否 則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會造成背景。
3 、也可以用小牛血清、 BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
7）抗體孵育條件的比較？
1 、一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、 37 度，其中4 度效果最佳；孵育時間： 這與溫度、抗體濃度有關， 一般 37 度 1-2h ，4 度過夜（從冰箱拿出后 37 度復溫 45min）。
2 、二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時間需要摸索。
8）一抗 4 度孵育后為什么要進行 37 度復溫？
1 、一方面，防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片；
2、另一方面，使抗原抗體結合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 度和 37 度時分子運動方式不同, 前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
9）DAB 顯色時間如何把握？
1 、DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間， 到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；
2 、DAB 顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間 過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；
3 、此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全， 需要延長封閉時間；
4 、DAB 顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最 好一抗 4 度過夜）； 另一方面就是封閉時間過長。
10）免疫組化結果如何分析？
1 、陽性著色細胞計數(shù)法。在 40×光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組 3~6 張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。
2 、灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進行灰密度分析， 然后進行統(tǒng)計分析即可。
3 、評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽 性范圍進行評分（1~4 分為 0~25% 、26~50% 、51~75% 、76~100%），最終可以分數(shù)相加， 再進行比較。
對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量 切片。
11）在什么情況下進行組織抗原修復， 抗原修復的條件是什么？
1 、由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。 通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
2 、修復方法從強到弱一般分為三種， 高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相 關資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。
3 、微波修復，一般用 6min*4 次，效果不錯。
12） 內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？
1、一般 3%過氧化氫滅活時間短點，可以 10min 左右；而 0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般 10~30min。
2 、用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片.
3 、現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4 度避光保存。
13）如何才能充分脫蠟？
1 、蠟不溶于水， 如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、真假難辨、背 景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯， 因它脫蠟
力強，脫蠟時間較短；
2 、脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮， 則脫蠟 時間不需很多，3-5 分鐘就已足夠。如果在冬天， 室溫較低， 脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長， 10-20 分鐘 或更長。
3 、當天切的切片， 燒烤 2 小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的 切片，在染色前，還必須對切片進行加溫 10-20 分鐘，然后再行脫蠟， 這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。
總之，操作時應根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地 脫去切片上的蠟。
14）如何最大限度地降低組織非特異性染色？
1 、縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。
2 、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3 、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加 滅活劑濃度來降低背景染色；
4、非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；
5 、縮短 DAB 孵育時間或降低 DAB 濃度/過氧化氫濃度等；
6 、適當增加 PBS 沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤為重要；
7 、防止標本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。
15）背景染色較深的原因有哪些？
1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試， 使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度， 既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書 進行染色。
2 、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是， 嚴格執(zhí)行操作規(guī)程， 最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒， 避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的 1 小時， 而是 30 分鐘，因此，要根據(jù)染色結果進行調整。
3、DAB 變質和顯色時間太長：DAB 最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的 DAB 不應存放時間太長， 因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產生反應而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰 箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB 的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終 止反應。不過當染色片太多時或用染色機時， 這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān) 控，避免顯色時間過長。
4 、組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變 干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈， 可以有效的避免液體流失， 也能提高操作速度。
5 、切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于 24 小時）：原因上不清楚， 但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天 將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在 4oC 冰箱過夜，對結果 無明顯影響，如果放在室溫， 特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此， 不可存放時間太長。
6 、一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期， 過期的抗體要么不顯色要么背景著色。用新買抗體時最 好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
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