題目：STAT3/TGFBI信號(hào)通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老上調(diào)糖酵解促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的替莫唑胺耐藥

英文名：STAT3/TGFBI signaling promotes the temozolomide resistance of glioblastoma through upregulating glycolysis by inducing cellular senescence

雜志：Cancer Cell International

影響因子：5.3

發(fā)表時(shí)間：2025年4月3日

研究背景：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）預(yù)后差且易對替莫唑胺（TMZ）產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞衰老在腫瘤中的雙重作用（促進(jìn)免疫清除或腫瘤進(jìn)展）機(jī)制尚不明確，且基于衰老相關(guān)基因的預(yù)后模型及耐藥機(jī)制需進(jìn)一步探索。

研究思路：研究者使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法組合構(gòu)建了一個(gè)基于CSRGs的預(yù)測模型（CSRGS）。通過分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本，將患者分為高CSRGS組和低CSRGS組，發(fā)現(xiàn)高CSRGS組患者預(yù)后更差，免疫浸潤更高，且對免疫檢查點(diǎn)阻斷療法更敏感。研究還發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞衰老相關(guān)的糖酵解途徑可能在GBM中起重要作用，TGFBI是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)受STAT3調(diào)控，并影響細(xì)胞衰老、糖酵解和替莫唑胺耐藥性。

研究結(jié)果：

1、識(shí)別預(yù)后GBM相關(guān)CSRG

采用圖1A所示程序進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先，共鑒定809個(gè)CSRGs。然后，通過交叉CSRGs和GBM與正常腦組織之間的常見DEGs鑒定270個(gè)GBM相關(guān)CSRGs。最后，通過單變量Cox回歸分析鑒定25個(gè)預(yù)后GBM相關(guān)CSRGs。這些基因的表達(dá)譜和預(yù)后價(jià)值如圖1B-C所示。

圖1

2、CSRGS的開發(fā)

為了開發(fā)預(yù)測性CSRGS特征（CSRGS），基于CoxBoost和Ridge組合算法（圖2A）建立了性能the best的最終CSRGS，CoxBoost算法識(shí)別了9個(gè)最有價(jià)值的CSRGS。在CGGA和TCGA數(shù)據(jù)集中，CSRGS評分高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）患者總生存期（OS）縮短（圖2B）。與此結(jié)果一致，CGGA數(shù)據(jù)集中1年、3年和5年OS的時(shí)間依賴性受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）值分別為0.611、0.723和0.718，而TCGA數(shù)據(jù)集中的AUC值分別為0.687、0.634和0.667，從而證實(shí)了CSRGS的預(yù)后意義（圖2C）。此外，計(jì)算了GBM患者臨床特征的C指數(shù)，并對這些臨床變量進(jìn)行了多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，CSRGS是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后決定因素，與年齡、性別、化療、放療、異檸檬酸脫氫酶（IDH）狀態(tài)以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）甲基化狀態(tài)等因素相當(dāng)。值得注意的是，在CGGA和TCGA數(shù)據(jù)集中，CSRGS的預(yù)測能力均優(yōu)于這些臨床特征（圖2D和E）。

圖2

3、CSRGS組的免疫特性和免疫治療反應(yīng)

如圖3A所示，幾乎所有類型的腫瘤浸潤細(xì)胞在高CSRGS組中都更高。同樣，基于CIBERSORT算法，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在高CSRGS組中更高，然而，活化的NK細(xì)胞和單核細(xì)胞在高CSRGS組中更低（圖3B）。如圖3C所示，經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)分子在高CSRGS組中表達(dá)顯著升高。此外，腫瘤微環(huán)境（TME）基因集和免疫表型調(diào)節(jié)因子基因集的評在高CSRGS組中也顯著更高（圖3D）。最后，免疫治療預(yù)測指標(biāo)GEP評分（圖3E）和CYT評分（圖3F）在高CSRGS組中的水平也顯著更高。

圖3

4、CSRGS的分子特征

如圖4A所示，正如預(yù)期的那樣，衰老相關(guān)生物學(xué)過程或通路的GSVA評分在高CSRGS組均顯著更高。為了進(jìn)一步研究CSRGS組的分子特征，選擇了由細(xì)胞成分、發(fā)育、DNA損傷、免疫、代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、通路和增殖八個(gè)過程類別組成的標(biāo)志性基因集，并使用GSVA算法進(jìn)行量化。如圖4B所示，幾乎所有基因集在高CSRGS組均顯著更高。在七條代謝途徑中，糖酵解在高CSRGS組相對于低組表現(xiàn)出maximum程度的升高。值得注意的是，糖酵解與衰老通路的相關(guān)性最強(qiáng)，表明高糖酵解是衰老的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個(gè)標(biāo)志。

圖4

5、TGFBI信號(hào)在GBM細(xì)胞的細(xì)胞衰老中起重要作用

為了進(jìn)一步篩選衰老GBM細(xì)胞中上調(diào)糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，交叉了GBM與正常腦組織之間的共同DEGs、預(yù)后CSRG和糖酵解相關(guān)基因。如圖5a所示，TGFBI被確定為衰老GBM細(xì)胞糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。IHC、western blot和RT-PCR檢測表明，與正常腦組織相比，TGFBI在GBM組織中高表達(dá)（圖5B-D）。與人星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA）相比，GBM細(xì)胞系（U87/U251）始終表現(xiàn)出TGFBI的顯著上調(diào)（圖5E和F）。為了探索TGFBI在GBM細(xì)胞衰老中的作用，通過轉(zhuǎn)染shRNA敲低U87和U251細(xì)胞中的TGFBI（圖5G和H）。如圖5I和圖J所示，與對照組（sh-NC）相比，TGFBI敲低顯著降低衰老標(biāo)志物P53和P16。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TGFBI在衰老中的作用，測試了阿霉素誘導(dǎo)的衰老GBM細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性的存在。如圖5K和L所示，SA-β-gal活性測定進(jìn)一步表明TGFBI沉默后顯著降低。這些結(jié)果表明，TGFBI促進(jìn)了GBM細(xì)胞的衰老。

圖5

6、TGFBI促進(jìn)GBM細(xì)胞的糖酵解和化療耐藥

由于糖酵解在衰老的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中顯著上調(diào)，進(jìn)一步探究了TGFBI在GBM細(xì)胞糖酵解中的作用。如圖6A-C所示，與陰性對照（sh-NC）相比，敲低TGFBI（sh-TGFBI）抑制了葡萄糖攝取，減少了乳酸生成，并降低了細(xì)胞內(nèi)ATP水平。OCR檢測表明，TGFBI基因敲低會(huì)損害線粒體呼吸，基礎(chǔ)呼吸和maximum呼吸減弱證明了這一點(diǎn)（圖6D-F、J-L）。同時(shí)，ECAR測量證實(shí)，與sh-NC組相比，sh-TGFBI細(xì)胞的糖酵解通量減弱，糖酵解和糖酵解能力均顯著降低（圖6G-I、M-O）?？傊?，上述結(jié)果表明，TGFBI促進(jìn)了GBM細(xì)胞的糖酵解。如圖6P所示，與sh-NC相比，TGFBI基因敲低增強(qiáng)了藥物療效，降低了替莫唑胺的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。這一結(jié)果表明，TGFBI促進(jìn)了GBM細(xì)胞的化學(xué)抗性。

圖6

7、STAT3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞中TGFBI的表達(dá)

進(jìn)一步探究了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中TGFBI上調(diào)的潛在機(jī)制。如圖7A和C所示，與正常腦組織相比，GBM組織中的TGFBI和STAT3顯著增加。此外，TGFBI與STAT3之間存在強(qiáng)正相關(guān)（圖7B和D）。此外，在GBM細(xì)胞系中敲低STAT3顯著降低了TGFBI蛋白和mRNA水平（圖7E-G）。為了研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控，利用JASPAR數(shù)據(jù)庫在TGFBI啟動(dòng)子中鑒定出一個(gè)STAT3結(jié)合位點(diǎn)（圖7H）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）結(jié)果顯示，STAT3占據(jù)了TGFBI啟動(dòng)子（圖7I），而熒光素酶報(bào)告基因檢測表明，TGFBI的轉(zhuǎn)錄激活依賴于STAT3（圖7J和K）?？傮w而言，這些結(jié)果表明，在GBM中STAT3作為TGFBI的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

圖7

8、TGFBI參與STAT3誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞衰老

先前的研究已確定STAT3是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?；谶@些發(fā)現(xiàn)，研究了TGFBI在STAT3誘導(dǎo)的衰老中的作用。如圖8A-D所示，STAT3敲低顯著導(dǎo)致衰老相關(guān)標(biāo)志物P53和P16死亡。然而，這種效應(yīng)可以通過過表達(dá)TGFBI來部分逆轉(zhuǎn)。此外，STAT3敲低顯著消除了衰老GBM細(xì)胞中SA-β-gal染色，而TGFBI的過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了這種減少（圖8E和F）。

圖8

10、TGFBI參與STAT3誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞糖酵解和化療耐藥

STAT3調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展和治療抗性的糖酵解代謝過程。為了研究TGFBI在GBM細(xì)胞中STAT3介導(dǎo)的糖酵解中的作用。檢測了U87和U251細(xì)胞中的葡萄糖利用、乳酸生成和細(xì)胞內(nèi)ATP水平。如圖8A-F所示，與陰性對照（NC）組相比，STAT3敲低（sh-STAT3）顯著降低了葡萄糖消耗、乳酸輸出和ATP水平，而TGFBI過表達(dá)部分挽救了這些影響。接下來，通過檢測耗氧率（OCR）評估線粒體氧化呼吸。與NC對照組相比，sh-STAT3組的線粒體呼吸降低，包括基礎(chǔ)呼吸和maximum呼吸降低（圖9G-I和M-O）。TGFBI過表達(dá)抵消了這些代謝改變。此外，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞外酸化率（ECAR）分析以證實(shí)STAT3-TGFBI在糖酵解調(diào)節(jié)中的作用。如圖9J-L和P-R所示，糖酵解通量和糖酵解能力被STAT3敲低所抑制，但在TGFBI過表達(dá)時(shí)恢復(fù)。

最后，探究了TGFBI在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中STAT3介導(dǎo)的化學(xué)抗性中的作用。如圖9S和9T所示，STAT3基因敲低顯著增強(qiáng)了U251和U87細(xì)胞系對藥物的反應(yīng)，而TGFBI過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)。

11、NF-κB可與STAT3-TGFBI協(xié)同作用

由于替莫唑胺（TMZ）耐藥機(jī)制復(fù)雜且存在相互作用，進(jìn)一步確定了其他與STAT3-TGFBI軸協(xié)同作用以促進(jìn)TMZ耐藥的調(diào)節(jié)因子。如圖10A所示，與正常腦組織相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）組織中NF-κB亞基P65、P50、P52和RELB顯著增加。此外，NF-κB亞基與STAT3之間存在強(qiáng)正相關(guān)（圖10B）。鑒于NF-κB調(diào)節(jié)主要的STAT3激活劑IL-6的轉(zhuǎn)錄，NF-κB可能與STAT3-TGFBI協(xié)同作用以促進(jìn)TMZ耐藥。

圖10

總結(jié)：研究通過機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建GBM衰老相關(guān)基因預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)STAT3調(diào)控TGFBI誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和糖酵解，增強(qiáng)替莫唑胺耐藥性，揭示STAT3-TGFBI軸可作為GBM衰老靶向治療新靶點(diǎn)。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！