題目：解毒三根湯抗結(jié)直腸癌的生物活性成分：一種新穎、全面的天然藥物開(kāi)發(fā)研究策略

英文名：Bioactive components of Jiedu Sangen decoction against colorectal cancer: A novel and comprehensive research strategy for natural drug development

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7

發(fā)表時(shí)間：2025年4月21日

研究背景：結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)病率和死亡率高，傳統(tǒng)中藥解毒三根湯（JSD）臨床療效顯著但活性成分未知。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，需結(jié)合多技術(shù)解析其作用機(jī)制，推動(dòng)天然藥物開(kāi)發(fā)。

研究思路：通過(guò)UPLC-MS/MS篩選JSD入血成分及代謝物，結(jié)合RNA-seq、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)（AHP-SOM算法）篩選關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)，利用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬及實(shí)驗(yàn)（SPR、MST）驗(yàn)證相互作用，闡明其抗CRC機(jī)制。

研究結(jié)果：

1、JSD顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖

JSD干預(yù)SW620細(xì)胞48小時(shí)和72小時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）如圖1A所示，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度梯度設(shè)定為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和3mg/ml。平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)，2mg/ml和3mg/ml的JSD可有效減少SW620細(xì)胞的增殖（如圖1B和C所示）。不同濃度梯度JSD干預(yù)SW620細(xì)胞7天的增殖曲線也證實(shí)了上述觀點(diǎn)（如圖1D所示）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和EdU實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，隨著JSD濃度的增加，對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯（如圖1E、F和H所示），圖片統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1G和I所示。

圖1

2、JSD化學(xué)成分譜的表征

鑒于中藥復(fù)方所含物質(zhì)的復(fù)雜性，使用UPLC-MS/MS對(duì)JSD進(jìn)行高通量成分分析是天然藥物開(kāi)發(fā)的具體體現(xiàn)。圖2A和B分別顯示了JSD在正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖（TIC），鑒定出的主要峰標(biāo)記為1-102。典型的化合物碎片模式如圖2C和D所示。

圖2

3、JSD成分在大鼠血漿中的檢測(cè)與表征

如圖3所示，空白血漿、含藥血漿和JSD的TIC存在顯著差異，表明僅通過(guò)表征水煎液的成分來(lái)解釋中藥復(fù)方的療效是片面的。共鑒定出18種原型成分和8種可能的代謝物，包括4種黃酮類、5種萜類、5種苯丙素類、3種酚類、2種蒽醌類和7種其他成分。

圖3

圖4

4、RNA-seq分析JSD干預(yù)結(jié)直腸癌細(xì)胞的綜合表征

對(duì)JSD干預(yù)后的SW620細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq分析，獲得了183個(gè)上調(diào)的mRNA和235個(gè)下調(diào)的mRNA（圖5a）。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG和GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)它們集中在多個(gè)與結(jié)直腸癌相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路，以及凋亡、免疫反應(yīng)、脂質(zhì)運(yùn)輸和鐵離子結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程和分子功能（圖5B-D）。功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的mRNA集中在跨膜運(yùn)輸、T細(xì)胞增殖和凋亡的負(fù)調(diào)控（圖5E）。熱圖和GO富集分析表征了JSD干預(yù)SW620細(xì)胞后變化的非編碼RNA（圖5F-H）。進(jìn)一步進(jìn)行共表達(dá)分析，以闡明JSD干預(yù)后差異表達(dá)的編碼和非編碼基因之間的相關(guān)性（圖5I）。

圖5

5、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析JSD生物活性成分抗CRC的潛在靶點(diǎn)和機(jī)制

基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了11,326個(gè)結(jié)直腸癌和正常組織中的差異表達(dá)基因。然后，結(jié)合TCMSP、Pubchem、SwissTarget等數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了JSD的18種入血成分和8種可能代謝物的1372個(gè)潛在靶點(diǎn)。取上述兩者的交集，獲得了JSD生物活性成分抗CRC的232個(gè)潛在靶點(diǎn)（圖6A）。對(duì)上述232個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析和可視化（圖6B）。對(duì)上述可能的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)它們集中在炎癥反應(yīng)、凋亡和中性粒細(xì)胞趨化等生物學(xué)過(guò)程。這些靶點(diǎn)作用于細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和染色體等多個(gè)細(xì)胞區(qū)域（圖6C）。它們顯著富集在PI3K/Akt信號(hào)通路、氮代謝等信號(hào)通路（圖6D）。繪制了JSD-活性成分-潛在靶點(diǎn)-機(jī)制通路圖（圖6E），為后續(xù)探索JSD抗CRC的有效生物活性成分及其分子生物學(xué)機(jī)制提供了方向。

圖6

6、生物信息學(xué)分析探索CRC關(guān)鍵靶點(diǎn)的生存預(yù)后及機(jī)器學(xué)習(xí)推導(dǎo)JSD核心生物活性成分

將獲得的JSD生物活性成分抗CRC的232個(gè)潛在靶點(diǎn)與JSD干預(yù)SW620細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因相結(jié)合，獲得了6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)：CA9、DOK7、DPEP1、NOTUM、CALB2和AKAP12（圖7A）。對(duì)TCGA、GTEx和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示，CA9、DOK7、DPEP1和NOTUM在CRC中上調(diào)，而CALB2和AKAP12在CRC中下調(diào)（圖7B和C）。JSD對(duì)6個(gè)靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)如圖S4B所示。使用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA-COADREAD進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)與患者的OS和PFI等預(yù)后密切相關(guān)（圖7D）。同時(shí)，它們的表達(dá)還與CRC患者的TMN分期和CEA水平相關(guān)（圖7E）。診斷ROC分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)可有效指示CRC的發(fā)生（圖7F）。接下來(lái)，分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC患者中這6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相關(guān)性以及與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。AKAP12和CALB2之間、NOTUM和DPEP1之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性（圖7G）。總體而言，NOTUM、DPEP1、DOK7和CA9的表達(dá)增加伴隨著各種免疫細(xì)胞的減少，而AKAP12和CALB2則觀察到相反的現(xiàn)象（圖7H）。JSD血漿中存在的26種生物活性成分與6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接表明，大多數(shù)活性成分可能與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有穩(wěn)定的結(jié)合（圖7I）。利用神經(jīng)元之間的關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證，染料木黃酮、阿夫澤林和白藜蘆醇是Most潛力的生物活性成分（圖7J）。綜上所述，獲得了JSD最有希望的生物活性成分及其干預(yù)CRC的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖7K）。

圖7

7、核心生物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬及驗(yàn)證

圖8A顯示了機(jī)器學(xué)習(xí)獲得的JSD的6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與3個(gè)最有希望的生物活性成分之間的分子對(duì)接結(jié)合能。選擇結(jié)合能minimum的三對(duì)“蛋白質(zhì)-小分子”復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)的分子動(dòng)力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（黃色圓圈表示）。圖8B-D是6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)最穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。

圖8

染料木黃酮-NOTUM、阿夫澤林-DPEP1和白藜蘆醇-CA9均位于靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，并在模擬過(guò)程中表現(xiàn)出良好的進(jìn)入模式（圖9A和B，圖10A和B，圖11A和B）。例如，白藜蘆醇的芳香環(huán)滲透到CA9的疏水核心區(qū)域；染料木黃酮的雙酚環(huán)與NOTUM進(jìn)入結(jié)合口袋；阿夫澤林的糖苷部分面向DPEP1的極性殘基，苯環(huán)嵌入疏水核心?？偰芰繛樨?fù)表明復(fù)合物在熱力學(xué)上趨于穩(wěn)定。阿夫澤林-DPEP1復(fù)合物的范德華能為-40kcal/mol，表明強(qiáng)疏水相互作用支持結(jié)合的穩(wěn)定性（圖9C，圖10C和圖11C）。CA9的關(guān)鍵殘基（如Leu、ARG等）對(duì)范德華力和靜電能有顯著貢獻(xiàn)，反映了這些殘基在結(jié)合位點(diǎn)穩(wěn)定性中的作用（圖9D）。NOTUM蛋白中的氨基酸殘基對(duì)能量有顯著貢獻(xiàn)，這些殘基有助于增強(qiáng)染料木黃酮的結(jié)合穩(wěn)定性（圖10D）。

圖9

圖10

DPEP1中的疏水殘基和極性氨基酸對(duì)能量有顯著貢獻(xiàn)，表明蛋白質(zhì)與阿夫澤林之間結(jié)合緊密（圖11D）。RMSD、SASA、Rg和RMSF分析表明，三種小分子（白藜蘆醇、染料木黃酮、阿夫澤林）在相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)合能力，結(jié)合后未誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的全局構(gòu)象變化。靶蛋白整體保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點(diǎn)在結(jié)合后表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性調(diào)整（圖9E-I，圖10E-I和圖11E-I）。此外，使用SPR和MST技術(shù)評(píng)估分子動(dòng)力學(xué)模擬的準(zhǔn)確性。SPR實(shí)驗(yàn)具有明顯的結(jié)合信號(hào)，擬合結(jié)果在濃度梯度范圍內(nèi)，表明結(jié)合具有特異性（圖9J，圖11J和圖13R）。MST擬合曲線呈“S”形，具有明顯的上下平臺(tái)和強(qiáng)濃度依賴性，表明結(jié)合具有特異性（圖9K，圖11K和圖13S）。

JSD的三種最有希望的生物活性成分對(duì)SW620細(xì)胞的殺傷作用及其對(duì)各自關(guān)鍵靶點(diǎn)的mRNA和蛋白質(zhì)水平的抑制作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性趨勢(shì)（圖10A-C，圖10J-L，圖12A-C，圖12G-I和圖13J-M）（圖10D-F，圖10M-O，圖12D-F，圖12J-L，圖13K-L和圖13N-Q）。結(jié)合上述KEGG富集通路結(jié)果，對(duì)白藜蘆醇和染料木黃酮干預(yù)后的SW620細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的WB實(shí)驗(yàn)，初步證明白藜蘆醇可能通過(guò)CA9/PI3K/AKT通路促進(jìn)CRC細(xì)胞凋亡，染料木黃酮可能靶向NOTUM下調(diào)b-catenin表達(dá)抑制CRC細(xì)胞增殖（圖10G-H和圖12M-N）。上述所有結(jié)果證明了研究策略揭示JSD抗CRC的“黑箱”理論的可行性，并為小分子藥物的開(kāi)發(fā)提供了全方位的支持。

圖11

圖12

圖13

總結(jié)：本研究建立了一種新穎的綜合研究策略，鑒定出JSD的核心活性成分為白藜蘆醇、染料木素和阿夫澤林，靶點(diǎn)為CA9、NOTUM和DPEP1，并揭示其通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT和β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抗CRC作用，為天然藥物開(kāi)發(fā)提供了新方向。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！