題目：骨肉瘤中多種程序性細(xì)胞死亡相關(guān)預(yù)后基因的整合分析和凋亡相關(guān)基因的功能驗(yàn)證

英文名：Integrated analysis of multiple programmed cell death-related prognostic genes and functional validation of apoptosis-related genes in osteosarcoma

雜志：International Journal of Biological Macromolecules

影響因子：7.7

發(fā)表時(shí)間：2025年3月13日

研究背景：骨肉瘤（OS）是一種預(yù)后較差的惡性骨腫瘤，傳統(tǒng)治療對(duì)轉(zhuǎn)移性/復(fù)發(fā)性患者效果有限。程序性細(xì)胞死亡（PCD）模式影響腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)，但單一PCD類型的研究無(wú)法全面反映OS異質(zhì)性，亟需整合多模式PCD基因構(gòu)建預(yù)后模型并探索靶向治療。

研究思路：本研究通過(guò)從TARGET-OS和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和臨床信息，并分析14種細(xì)胞死亡模式的基因，建立細(xì)胞死亡指數(shù)（CDI）簽名?；贑DI計(jì)算的七種基因與轉(zhuǎn)移相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)列線圖模型來(lái)有效預(yù)測(cè)骨肉瘤患者的預(yù)后。通過(guò)免疫組化驗(yàn)證了CDI模型中的核心基因GALNT14與不良生存的相關(guān)性，并研究了GALNT14的缺失對(duì)骨肉瘤進(jìn)展和細(xì)胞增殖的影響。研究還探討了靶向GALNT14的藥物Bortezomib如何提高化療敏感性，并闡明了其作用機(jī)制。

研究結(jié)果：

1、骨肉瘤中細(xì)胞死亡簇的鑒定

為探究不同細(xì)胞死亡途徑對(duì)骨肉瘤（OS）患者預(yù)后的影響，使用基因集變異分析（GSVA）計(jì)算14種細(xì)胞死亡模式的評(píng)分，發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞死亡途徑間存在顯著相關(guān)性（圖2A）。單因素Cox回歸分析顯示，免疫原性細(xì)胞死亡、Parthanatos、Entotic細(xì)胞死亡、溶酶體依賴性細(xì)胞死亡、壞死性凋亡和焦亡與OS預(yù)后顯著相關(guān)（圖2B）。通過(guò)對(duì)14種細(xì)胞死亡評(píng)分進(jìn)行無(wú)監(jiān)督共識(shí)聚類分析，結(jié)合累積分布函數(shù)（CDF）值及曲線（圖2C），確定聚類指數(shù)‘k’=2時(shí)the best，進(jìn)而鑒定出兩種細(xì)胞死亡簇：簇1（C1）和簇2（C2），分別包含39和46個(gè)樣本（圖2D）。模糊聚類比例（圖2E）和主成分分析（PCA，圖2F）驗(yàn)證了聚類結(jié)果的穩(wěn)定性和兩簇間的分離。Kaplan-Meier分析表明C1預(yù)后顯著較差（圖2G），復(fù)發(fā)率更高（圖2H）。除網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞死亡、氧化凋亡和銅死亡外，其余11種細(xì)胞死亡評(píng)分在各簇間存在顯著差異（圖2I），且簇間臨床參數(shù)也存在顯著差異，C1特征為多種細(xì)胞死亡途徑水平升高且死亡率更高（圖2J）。

圖2

2、不同細(xì)胞死亡簇的免疫狀態(tài)和功能分析

為了闡明每個(gè)簇的免疫反應(yīng)，探討了細(xì)胞死亡簇之間的免疫差異。結(jié)果顯示，與C2相比，C1的基質(zhì)和免疫評(píng)分顯著較低，腫瘤純度顯著較高，總體生存率較差（圖3A）。
C1顯示出各種免疫細(xì)胞類型（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞）的浸潤(rùn)顯著低于C2（圖3B）。CIBERSORT分析揭示了不同的巨噬細(xì)胞極化模式，與C1相比，C2的M1和M2巨噬細(xì)胞比例更高，M0巨噬細(xì)胞比例更低（圖3C），基因集變異分析（GSVA）發(fā)現(xiàn)，C2中炎癥信號(hào)通路顯著富集，包括通過(guò)NFκB的TNFα信號(hào)傳導(dǎo)、缺氧、IL-6/JAK/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡（圖3D）?；蚣患治觯℅SEA）進(jìn)一步支持了這些發(fā)現(xiàn)，揭示了與炎癥相關(guān)的通路富集，如精子發(fā)生、補(bǔ)體、凋亡、IL-6信號(hào)傳導(dǎo)和IL-2/STAT5信號(hào)傳導(dǎo)（圖3E）。

圖3

3、細(xì)胞死亡指數(shù)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究?jī)蓚€(gè)簇之間的基因變異，進(jìn)行了簇間差異表達(dá)分析。共鑒定出56個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）（圖4A）。進(jìn)行了這些DEGs的GO、KEGG通路分析（圖4B,C）?？傊?，結(jié)果表明，PCD基因表達(dá)與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和癌癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

為了構(gòu)建穩(wěn)健的預(yù)后模型，基于DEGs的兩個(gè)亞組通過(guò)單因素Cox回歸分析鑒定出51個(gè)預(yù)后相關(guān)基因（圖4D）。隨后，使用LASSO Cox回歸分析得出一個(gè)包含7個(gè)基因的特征，包括ACTA2、GALNT14、F13A1、MS4A4A、EVI2B、GRN和SELPLG（圖4E-G）。CDI分組和患者生存狀態(tài)的散點(diǎn)圖以及Kaplan-Meier生存分析表明，高CDI組患者的預(yù)后顯著較差（圖4H,I）。時(shí)間依賴性受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，CDI具有強(qiáng)大的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，1年、3年和5年的曲線下面積（AUC）值分別為0.817、0.810和0.837（圖4J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CDI是OS的有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖4

4、CDI特征的外部驗(yàn)證及其與免疫治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CDI的預(yù)后效用，使用GSE21257和GSE39055數(shù)據(jù)集進(jìn)行了外部驗(yàn)證（圖5a,B）。CDI在這些獨(dú)立隊(duì)列中對(duì)總生存期具有強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。CDI評(píng)分較高的患者更有可能發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且總生存期較差（圖5C,D）。CDI在C指數(shù)方面始終優(yōu)于這些模型（圖5E）。分析了CDI與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)17種免疫細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著相關(guān)（圖5F）。此外，分析了27種免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性。該分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與13種免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平顯著相關(guān)（圖5F）。因此，CDI特征可能是代表抗腫瘤免疫狀態(tài)和預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。

圖5

5、基于臨床特征和CDI的列線圖的建立與評(píng)估

單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，CDI和轉(zhuǎn)移狀態(tài)是總生存期的重要預(yù)測(cè)因子（圖6A,B）,構(gòu)建了一個(gè)包含CDI評(píng)分和轉(zhuǎn)移狀態(tài)的列線圖，其C指數(shù)為0.840，顯示出優(yōu)異的預(yù)測(cè)性能（圖6C）。校準(zhǔn)圖證實(shí)了列線圖在預(yù)測(cè)1年、3年和5年總生存率方面的準(zhǔn)確性（圖6D）。Kaplan-Meier生存分析和時(shí)間依賴性受試者工作特征（ROC）曲線分析進(jìn)一步驗(yàn)證了列線圖的預(yù)后價(jià)值（圖6E,F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，所開(kāi)發(fā)的列線圖是預(yù)測(cè)OS患者預(yù)后的有價(jià)值工具，可能有助于臨床決策。

圖6

6、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析和特征基因的驗(yàn)證

分析OS單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE162454，該數(shù)據(jù)集包含28個(gè)細(xì)胞簇和8種不同細(xì)胞類型（圖7A-C）。通過(guò)RT-qPCR在不同細(xì)胞系中分析CDI模型中7個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)所有7個(gè)基因在OS細(xì)胞中均有表達(dá)，其中6種OS細(xì)胞系的GALNT14表達(dá)水平通常高于成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）（圖7D）。在7個(gè)基因中，GALNT14是Most影響力的促癌基因。生存分析顯示，高GALNT14組生存時(shí)間更短（圖7E）。將OS患者組織樣本分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組后，免疫組織化學(xué)染色表明高風(fēng)險(xiǎn)患者組GALNT14蛋白表達(dá)水平顯著更高（圖7F），這一系列結(jié)果表明GALNT14在高侵襲性O(shè)S細(xì)胞系和高風(fēng)險(xiǎn)OS患者中高表達(dá)。

圖7

7、 GALNT14缺失通過(guò)促進(jìn)體外凋亡和抑制體內(nèi)OS細(xì)胞增殖顯著抑制OS進(jìn)展

為探究GALNT14在骨肉瘤（OS）進(jìn)展中的作用，將陰性對(duì)照或siRNA（si-NT14–1、si-NT14–2和si-NT14–3）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到U2OS和Saos-2細(xì)胞系中。RT-qPCR和Westernblotting結(jié)果顯示，si-NT14–1和si-NT14–2顯著敲低了細(xì)胞中GALNT14的表達(dá)（圖8A、8B）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）和克隆形成試驗(yàn)（圖8C、8D）表明，GALNT14缺失減弱了U2OS和Saos-2細(xì)胞的增殖能力。Transwell和傷口愈合試驗(yàn)（圖8E-8G）證實(shí)，敲低GALNT14后，細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，表明敲低GALNT14表達(dá)在體外對(duì)OS進(jìn)展產(chǎn)生負(fù)面影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，sh-NT14組的腫瘤生長(zhǎng)速率（體積和重量）顯著低于sh-NC組（P<0.01，圖8H-8J），在MG63和Hos細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果（圖8K）。MitotrackerRed試驗(yàn)顯示，GALNT14敲低降低了OS細(xì)胞的線粒體膜電位（圖8L）；DCFH-DA探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低后細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高（圖8M）；Lyso-TrackerRed檢測(cè)表明，GALNT14敲低降低了細(xì)胞的溶酶體熒光強(qiáng)度（圖8N）。此外，GALNT14敲低的OS細(xì)胞中，裂解的半胱天冬酶3和裂解的PARP蛋白水平升高（圖8O），TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色顯示凋亡率更高（圖8P）。綜上，GALNT14敲低可促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡，抑制體內(nèi)OS細(xì)胞增殖，顯著抑制OS進(jìn)展。

圖8

8、硼替佐米通過(guò)降低GALNT14表達(dá)抑制增殖、遷移和侵襲

為探究GALNT14的小分子抑制劑，經(jīng)文獻(xiàn)篩選，發(fā)現(xiàn)硼替佐米（BTZ）可能是潛在抑制劑。經(jīng)分子對(duì)接分析和細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移試驗(yàn)（圖9A、9B），證實(shí)BTZ能直接結(jié)合GALNT14且結(jié)合親和力較強(qiáng)。體外實(shí)驗(yàn)中，克隆形成試驗(yàn)（圖9D）、傷口愈合試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)（圖9E、9F）表明，BTZ抑制了Saos-2細(xì)胞的增殖能力，阻礙了U2OS和Saos-2細(xì)胞的遷移和侵襲。CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，BTZ與順鉑、洛鉑和阿霉素聯(lián)合治療，協(xié)同抑制了U2OS和Saos-2細(xì)胞的增殖。同時(shí)，BTZ處理后的細(xì)胞，線粒體膜電位、半胱天冬酶-3活性、細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及溶酶體完整性和活性的變化與GALNT14敲低效果一致（圖9I-9K），且誘導(dǎo)了更高的凋亡率（圖9L、9M）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將Saos-2細(xì)胞皮下移植到BALB/c裸鼠體內(nèi)，用生理鹽水、1mg/kgBTZ或1mg/kgBTZ+3mg/kg順鉑聯(lián)合治療小鼠（圖9N）。結(jié)果顯示，BTZ治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢，順鉑與BTZ聯(lián)合治療進(jìn)一步降低了腫瘤的重量和體積（圖9O-9Q），表明BTZ通過(guò)增加細(xì)胞凋亡敏感性來(lái)抑制增殖，順鉑與BTZ聯(lián)合治療在體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，BTZ介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)了化療敏感性。

圖9

9、硼替佐米（BTZ）通過(guò)抑制GALNT14的表達(dá)減少M(fèi)T2A的糖基化以提高其穩(wěn)定性，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

O-糖基化起始酶GALNT14可調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和凋亡敏感性，假設(shè)其通過(guò)下游蛋白質(zhì)糖基化修飾影響OS細(xì)胞凋亡。利用凝集素微陣列檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GALNT14敲低或BTZ處理后，U2OS細(xì)胞中多種糖型表達(dá)降低，尤其是大豆凝集素（SBA）和野豌豆凝集素（VVA）識(shí)別的糖型（圖10A）。層次聚類分析熱圖及WB結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，BTZ通過(guò)抑制GALNT14表達(dá)促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡（圖10B-F）。研究發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白2A（MT2A）是GALNT14介導(dǎo)的O-糖基化候選底物（圖10G-I）。BTZ處理會(huì)因降低GALNT14表達(dá)，減少VVA介導(dǎo)下拉捕獲的MT2A（圖10J）。敲低GALNT14或用BTZ處理均增加內(nèi)源性MT2A表達(dá)，提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)半衰期（圖10K-O）。MT2A過(guò)表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，提高凋亡率（圖10P-R），敲低GALNT14同時(shí)過(guò)表達(dá)MT2A，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增強(qiáng)（圖10S）。

圖10

總結(jié)：本研究整合多模式PCD基因構(gòu)建了OS預(yù)后模型（CDI）和列線圖，發(fā)現(xiàn)GALNT14通過(guò)糖基化修飾MT2A促進(jìn)OS進(jìn)展，靶向藥物BTZ可抑制GALNT14并增強(qiáng)化療敏感性，為OS精準(zhǔn)治療提供了新方向。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！