題目：CASC8通過(guò)c-Myc-GLUT1軸激活磷酸戊糖途徑抑制胰腺導(dǎo)管腺癌中的雙硫死亡

英文名：CASC8 activates the pentose phosphate pathway to inhibit disulfidptosis in pancreatic ductal adenocarcinoma though the c-Myc-GLUT1 axis

雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影響因子：12.8

發(fā)表時(shí)間：2025年1月27日

研究背景：胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是高度侵襲性的消化道惡性腫瘤，雖僅占所有癌癥的3%，卻為美國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。程序性細(xì)胞死亡（如鐵死亡、壞死性凋亡等）在PDAC應(yīng)激條件下的發(fā)展中起重要作用，而雙硫死亡作為一種代謝相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡，在PDAC中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確。lncRNA CASC8在PDAC代謝和雙硫死亡中的功能及分子機(jī)制也有待闡明。

研究思路：通過(guò)分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中PDAC樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，鑒定雙硫死亡相關(guān)基因（DRGs）和lncRNA（DRLs），構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型并發(fā)現(xiàn)CASC8高表達(dá)與PDAC不良預(yù)后相關(guān)；隨后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（敲低/過(guò)表達(dá)CASC8）和動(dòng)物模型（皮下移植瘤、原位移植瘤）探究其對(duì)PDAC細(xì)胞增殖、遷移及雙硫死亡的影響；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、代謝組測(cè)序、RNA免疫沉淀等技術(shù)，揭示CASC8通過(guò)與c-Myc結(jié)合增強(qiáng)其穩(wěn)定性，激活磷酸戊糖途徑，降低NADP?/NADPH比值，從而抑制雙硫死亡的分子機(jī)制。

研究結(jié)果：

1、PDAC中雙硫死亡及雙硫死亡相關(guān)基因的表達(dá)模式

先前研究總結(jié)了24個(gè)雙硫死亡相關(guān)基因（DRGs），分析TCGA-PAAD和GTEx數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)DRGs在PDAC中高表達(dá)，突變率低，ACTN4、TLN1 CNV擴(kuò)增最多，CAPZB、NUDFA11 CNV缺失，且有11個(gè)基因與PDAC預(yù)后相關(guān)（圖1A-F）。評(píng)估PDAC細(xì)胞系SLC7A11表達(dá)后，選4個(gè)高表達(dá)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，顯示葡萄糖饑餓使PI陽(yáng)性細(xì)胞增多，DTT和TCEP可逆轉(zhuǎn)，且細(xì)胞出現(xiàn)F-肌動(dòng)蛋白收縮等變化，提示雙硫死亡可能促進(jìn)PDAC進(jìn)展（圖1G-J）。

圖1

2、基于雙硫死亡相關(guān)lncRNA的風(fēng)險(xiǎn)特征在PDAC中的構(gòu)建

為鑒定雙硫死亡相關(guān)lncRNA（DRLs），用limma包分析PDAC樣本，按|cor|≥0.3且P≤0.001得173個(gè)DRLs（圖2A）；將TCGA樣本分訓(xùn)練和測(cè)試組，經(jīng)相關(guān)分析確定5個(gè)關(guān)鍵DRLs（含CASC8）建立風(fēng)險(xiǎn)特征（圖2B）。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CASC8在PDAC中高表達(dá)，與較短O(píng)S和DFS相關(guān)（圖2C-E）；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、FISH及CISH驗(yàn)證其主要定位于腫瘤細(xì)胞，且表達(dá)高于正常和慢性胰腺炎組織，或?yàn)镻DAC進(jìn)展預(yù)測(cè)指標(biāo)（圖2F-I）。

圖2

3、CASC8在體外葡萄糖饑餓條件下抑制PDAC細(xì)胞的雙硫死亡

雙硫死亡是代謝應(yīng)激和葡萄糖饑餓觸發(fā)的細(xì)胞死亡，與蛋白質(zhì)二硫鍵形成相關(guān)。研究CASC8（雙硫死亡相關(guān)lncRNA）發(fā)現(xiàn)，葡萄糖饑餓下，CASC8敲低使PI陽(yáng)性死亡細(xì)胞顯著增加，還原劑可逆轉(zhuǎn)；過(guò)表達(dá)則減少PI陽(yáng)性細(xì)胞（圖3A-G）。熒光染色顯示CASC8敲低細(xì)胞有F-肌動(dòng)蛋白收縮等雙硫死亡形態(tài)（圖3H），表明其在調(diào)節(jié)PDAC細(xì)胞雙硫死亡中起重要作用。

圖3

4、CASC8在體內(nèi)抑制PDAC雙硫死亡

為了研究CASC8在體內(nèi)對(duì)雙硫死亡的影響，使用慢病毒短發(fā)夾RNA（shRNA）構(gòu)建體建立了穩(wěn)定的CASC8敲低PDAC細(xì)胞。隨后，開(kāi)發(fā)了皮下異種移植腫瘤模型。與對(duì)照組的異種移植物相比，五只注射了sh-CASC8細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出顯著更低的腫瘤負(fù)荷（P<0.001）（圖4A-C）。值得注意的是，用3mg/kg的BAY-876（一種模擬葡萄糖饑餓的GLUT1抑制劑）處理產(chǎn)生了類(lèi)似的抗腫瘤效果，表明CASC8與體內(nèi)葡萄糖代謝之間存在潛在聯(lián)系（P<0.001）。對(duì)石蠟包埋的異種移植腫瘤進(jìn)行了Ki-67的IHC染色、CASC8的CISH以及TUNEL測(cè)定（圖4D）。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步采用了原位異種移植模型，將腫瘤細(xì)胞植入小鼠胰腺。與皮下模型的結(jié)果一致，陰性對(duì)照組的五只小鼠與sh-CASC8組相比，發(fā)展出明顯更大和更重的腫瘤（P=0.0065）。重要的是，在原位模型中用3mg/kg的BAY-876處理維持了這種觀察到的腫瘤大小差異（P<0.001）（圖4E-F）。同時(shí)，IHC結(jié)果還表明對(duì)照組比sh-CASC8組具有更強(qiáng)的增殖能力（圖4G）?？傮w而言，這些體內(nèi)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明CASC8可以抑制PDAC細(xì)胞中的雙硫死亡，可能通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。

圖4

5、CASC8與PDAC細(xì)胞中的磷酸戊糖途徑相關(guān)

為闡明CASC8調(diào)控PDAC進(jìn)展和雙硫死亡的機(jī)制，對(duì)CASC8敲低細(xì)胞及對(duì)照進(jìn)行RNA-seq，GO、KEGG和GSEA分析顯示對(duì)照組基因富集于糖酵解和磷酸戊糖途徑（圖5a）。qRT-PCR、Western blotting等證實(shí)CASC8敲低下調(diào)ENO1、GLUT1等，減少GLUT1蛋白（圖5B-C）。CASC8敲低還下調(diào)磷酸戊糖途徑相關(guān)基因，增加NADP?/NADPH比值，降低葡萄糖攝取，過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則相反；代謝組學(xué)顯示其影響相關(guān)代謝物水平，表明CASC8顯著影響PDAC細(xì)胞的磷酸戊糖途徑（圖5D-M）。

圖5

6、CASC8能夠結(jié)合c-Myc并調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性

為闡明CASC8表達(dá)增加如何促進(jìn)磷酸戊糖途徑的潛在機(jī)制，對(duì)TCGA-PAAD數(shù)據(jù)集進(jìn)行了GSEA分析。該分析揭示了CASC8表達(dá)與c-Myc靶基因表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性（圖6A）。這一結(jié)果通過(guò)RNA測(cè)序進(jìn)一步得到證實(shí)（圖6B）。c-Myc轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)基本細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞中，快速增殖和生長(zhǎng)通常導(dǎo)致對(duì)能量的需求增加。為滿(mǎn)足這一需求，腫瘤常表現(xiàn)出c-Myc的過(guò)表達(dá)或異常激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖酵解和磷酸戊糖途徑等葡萄糖代謝途徑，為癌細(xì)胞提供充足能量。基于這些觀察結(jié)果，假設(shè)CASC8可能與c-Myc蛋白相互作用，可能通過(guò)激活下游效應(yīng)分子來(lái)發(fā)揮其功能。RNA免疫沉淀（RIP）和共定位實(shí)驗(yàn)為這一假設(shè)提供了初步支持（圖6C-E）。Westernblotting分析進(jìn)一步揭示，在CASC8敲低后，c-Myc蛋白水平顯著降低，而CASC8過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致c-Myc蛋白水平升高，無(wú)論是否存在葡萄糖（圖6F-I）。為研究蛋白穩(wěn)定性，用10μg/mL的環(huán)己酰亞胺（CHX）處理細(xì)胞，以抑制蛋白合成六小時(shí)。該實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，CASC8敲低細(xì)胞的c-Myc降解速率顯著增加（圖6J-K）。此外，敲低CASC8顯著降低了下游c-Myc靶基因的mRNA水平（圖6L）。綜合這些發(fā)現(xiàn)表明，CASC8可以與c-Myc蛋白結(jié)合，促進(jìn)其穩(wěn)定性，從而激活下游效應(yīng)分子。

圖6

7、CASC8通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc在體外促進(jìn)PDAC生長(zhǎng)和遷移

為探究CASC8與c-Myc在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）進(jìn)展中的功能關(guān)系，在CASC8敲低細(xì)胞中過(guò)表達(dá)c-Myc，在CASC8過(guò)表達(dá)細(xì)胞中敲低 c-Myc，蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證了操作效力（圖 7A-B）。對(duì)不同 PDAC細(xì)胞組的相對(duì) NADP+/NADPH 比例和葡萄糖攝取研究顯示，CASC8敲低細(xì)胞中過(guò)表達(dá)c-Myc可減弱NADP+/NADPH比例的增加，并挽救葡萄糖攝取的減少（圖7C-D）；CASC8過(guò)表達(dá)細(xì)胞中敲低c-Myc則效果相反（圖7E-F）。葡萄糖饑餓條件下，CASC8敲低細(xì)胞中過(guò)表達(dá)c-Myc顯著減少二硫鍵形成細(xì)胞（圖7G-I）。這些表明，葡萄糖缺乏時(shí)CASC8通過(guò) c-Myc 依賴(lài)性機(jī)制促進(jìn)PDAC細(xì)胞存活。

圖7

8、CASC8通過(guò)c-Myc在體內(nèi)抑制PDAC二硫鍵形成

之前體外研究提示CASC8通過(guò)c-Myc抑制胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的氧化蛋白聚集。為在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證c-Myc是CASC8在PDAC氧化蛋白聚集中的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，采用了皮下異種移植模型。在注射BAY-876后，接種sh-CASC8+c-Myc細(xì)胞的五只小鼠腫瘤體積和重量顯著增加，與sh-CASC8組相比（圖8A-C）。石蠟包埋的異種移植腫瘤進(jìn)行Ki-67、c-Myc和CISH（CASC8）的免疫組化（IHC）染色，以及TUNEL檢測(cè)。與sh-CASC8組相比，sh-CASC8+c-Myc組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比例更高，死亡細(xì)胞更少（圖8D）。這些結(jié)果在原位異種移植模型中得到證實(shí)，其中c-Myc過(guò)表達(dá)導(dǎo)致四只攜帶CASC8敲低細(xì)胞的腫瘤負(fù)荷增加（圖8E-F）。綜合這些體內(nèi)數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，c-Myc作為CASC8調(diào)節(jié)氧化蛋白聚集的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子。

圖8

總結(jié)：本研究證實(shí)胰腺導(dǎo)管腺癌中存在二硫化物應(yīng)激反應(yīng)，揭示CASC8高表達(dá)與PDAC患者不良預(yù)后相關(guān)，且CASC8通過(guò)與c-Myc結(jié)合增強(qiáng)其穩(wěn)定性，激活戊糖磷酸途徑，降低NADP+/NADPH比值，抑制二硫化物應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)PDAC進(jìn)展。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專(zhuān)屬服務(wù)為您排憂(yōu)解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！