題目：一種新的干性相關(guān)lncRNA特征可預(yù)測透明細胞腎細胞癌的預(yù)后、免疫浸潤和藥物敏感性

英文名：A novel stemness-related lncRNA signature predicts prognosis, immune infiltration and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma

雜志：Journal of Translational Medicine

影響因子：7.5

發(fā)表時間：2025年2月27日

研究背景：透明細胞腎細胞癌（ccRCC）是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有異質(zhì)性。干性是腫瘤進展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，但其對ccRCC預(yù)后的影響尚不明確。長非編碼RNA（lncRNA）可調(diào)控基因表達，與ccRCC的增殖、凋亡等過程有關(guān)，但干性相關(guān)lncRNA（SRlncRNA）在ccRCC中的表達和作用尚不清楚。

研究思路：本研究旨在探討ccRCC中的SRlncRNA，并開發(fā)用于風(fēng)險分層和預(yù)后預(yù)測的特征。研究者從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫下載基因表達和臨床數(shù)據(jù)，計算樣本的RNA干性得分（RNAss），通過加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）識別SRlncRNA和干性相關(guān)mRNA（SRmRNA），并進行功能富集分析。利用多種機器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建預(yù)后特征，在TCGA-KIRC和GSE29609隊列中進行訓(xùn)練和驗證，并分析在預(yù)后、免疫浸潤、藥物敏感性、突變景觀和基因集富集分析（GSEA）等方面的差異。此外，研究者還開發(fā)了基于網(wǎng)絡(luò)的計算器以方便臨床應(yīng)用，并通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）以及體外和體內(nèi)實驗進一步驗證SRlncRNA在ccRCC中的表達和作用。

研究結(jié)果：

1、SRlncRNAs和SRmRNAs的篩選

基于RNA干細胞評分（RNAss）和加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），在TCGA-KIRC隊列中，通過設(shè)定軟閾值β=6構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)，識別出與RNAss相關(guān)性highest的MEgrey模塊，從中篩選出452個干性相關(guān)lncRNA（SRlncRNAs）。對于mRNA，MEorange、MElightcyan、MEblack和MEtan模塊與RNAss的相關(guān)性均≥0.5，共包含1907個mRNA，進一步篩選得到1005個干性相關(guān)mRNA（SRmRNAs）（圖1A-H）。

圖1

2、SRmRNAs的功能富集

從SRmRNAs中鑒定出787個差異表達基因（DEGs），包括413個上調(diào)基因和374個下調(diào)基因（圖2A）?；虮倔w論（GO）分析顯示，這些DEGs主要富集于神經(jīng)發(fā)生正調(diào)控、腺體發(fā)育、神經(jīng)元分化正調(diào)控等生物學(xué)過程，核染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等細胞組分，以及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能（圖2C）。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析表明，DEGs顯著富集于EB病毒感染、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細胞衰老和TGF-β信號通路等（圖2D）。

圖2

3、SRlncRNA特征和ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在TCGA-KIRC隊列中，通過101種算法組合及留一法交叉驗證（LOOCV），篩選出LASSO回歸結(jié)合逐步Cox回歸為optimal模型（平均C-index=0.716）。該模型最終納入10個SRlncRNA，經(jīng)多變量Cox回歸確定6個核心SRlncRNA構(gòu)建預(yù)后特征，包括LINC01711、LINC00944、AC245128.3、AL162586.1（風(fēng)險因子），以及AC002070.1、EMX2OS（圖3A-D）。

圖3

以中位風(fēng)險評分將患者分為高、低風(fēng)險組，TCGA隊列中高風(fēng)險組預(yù)后顯著更差（圖4A-C），1年、3年、5年生存預(yù)測的AUC分別為0.762、0.761、0.792（圖4D），且C-index高于142個已發(fā)表的ccRCC預(yù)后模型（圖4E）。

圖4

使用來自GSE29609隊列的數(shù)據(jù)驗證簽名。與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組患者的OS明顯較短（圖5a）。按風(fēng)險評分升序繪制每位患者的表達熱圖（圖5B）。隨著風(fēng)險評分的增加，死亡患者的比例也增加（圖5C）。ROC曲線顯示，預(yù)測1年、3年和5年生存的簽名的AUC值分別為0.800、0.868和0.851（圖5D）。與其他99個已發(fā)表的簽名相比，SRlncRNA簽名在GSE29609隊列中表現(xiàn)出良好的預(yù)測價值（圖5E）。

圖5

4、功能分析

基因集富集分析（GSEA）結(jié)果顯示，α-亞麻酸代謝、細胞因子受體相互作用、子宮內(nèi)膜癌、同源重組和免疫球蛋白A（IgA）產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)在高風(fēng)險組中富集最為顯著。而原發(fā)性免疫缺陷、前列腺癌、近端小管碳酸氫鹽重吸收、緊密連接和血管加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收在低風(fēng)險組中富集（圖6A）。同樣，GO通路的富集情況如圖6B所示。

圖6

5、免疫浸潤

免疫浸潤分析顯示，高風(fēng)險組中性粒細胞、髓系樹突狀細胞（TIMER算法）及Treg細胞、活化NK細胞等（CIBERSORT算法）浸潤水平更高，且免疫功能評分（如干擾素γ產(chǎn)生、白細胞介素17產(chǎn)生）顯著升高（圖7A-D）。高風(fēng)險組TIDE評分更低，對免疫治療反應(yīng)更好，SubMap分析證實其與免疫治療隊列更相似，CheckMate隊列中EMX2OS高表達患者免疫治療預(yù)后更佳（圖7E-H）。

圖7

6、藥物敏感性分析

藥物敏感性預(yù)測顯示，低風(fēng)險組對比卡魯胺、拉帕替尼等更敏感，高風(fēng)險組對JNK抑制劑VIII等敏感；結(jié)合L1000FWD、CMap和DGIdb數(shù)據(jù)庫，篩選出7個潛在藥物（美苯達唑、柔紅霉素等，圖8B-C）。

圖8

突變分析表明，高、低風(fēng)險組均以VHL、PBRM1、TTN、SETD2為高頻突變基因，但高風(fēng)險組BAP1和SETD2突變頻率更高，且腫瘤突變負荷（TMB）顯著升高（P<0.01，圖9A-F）。

圖9

7、預(yù)后預(yù)測模型的構(gòu)建

選擇具有完整人口學(xué)、臨床病理學(xué)和預(yù)后記錄的樣本來制作列線圖。單變量分析確定年齡、分級、分期、T分期、M分期和風(fēng)險評分是OS的潛在預(yù)測因子（ 圖  10 A-B）?；谶@些因素，構(gòu)建了預(yù)測OS的列線圖（圖  10 C）。通過將每個因素的相應(yīng)分數(shù)相加，可以計算出每個患者的總分。該列線圖將臨床和病理特征與新的SRlncRNA相關(guān)預(yù)后特征相結(jié)合，C統(tǒng)計量為0.770（95%CI0.751-0.790）。

圖10

8、SRlncRNAs的單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組分析

通過分析ccRCC的scRNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出前2000個變量特征，經(jīng)降維后識別出33個細胞集群，將細胞分為8種細胞類型：惡性細胞、單核細胞/巨噬細胞、上皮細胞、漿細胞、內(nèi)皮細胞、CD8T細胞、成紅細胞和周細胞。EMX2OS和LINC00944在惡性細胞中低表達和高表達，其表達與細胞分化軌跡相關(guān)，敲低后影響細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變（圖11A-O）。

圖11

計算了每種細胞類型的CNV評分，揭示了惡性細胞的不同特征（圖12 A-B）的使用Leiden算法的進一步分析將細胞分為14個不同的集群。值得注意的是，與其他細胞類型相比，惡性細胞的CNV評分顯著升高（圖  12 C）。在惡性細胞群中，LINC00944表達高的細胞比LINC00944表達低的細胞表現(xiàn)出更高的CNV評分（圖  12 D）。

圖12

還深入研究了SRlncRNA表達與CytoTRACE評分之間的關(guān)聯(lián)（圖  13 A-D）。在所有細胞類型中，惡性細胞的CytoTRACE評分highest（圖  13 E），EMX2OS和LINC00944的表達與CytoTRACE評分顯著相關(guān)。

圖13

為了更深入地了解emX2OS和LINC00944在ccRCC中的空間表達模式，對從具有代表性的腫瘤-正常界面獲得的空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行了全面分析（圖 14 A-D）的細胞類型注釋如圖 14 C、F所示 。在ccRCC中，EMX2OS和LINC00944的表達在tumo和正常組織之間的邊界上分布不均勻（圖  14 B、E）。

圖14

9、ccRCC中EMX2OS和LINC00944的下調(diào)影響體外增殖、遷移和侵襲

利用靶向shRNA特異性敲低ccRCC細胞系中EMX2OS和LINC00944的表達，從而對兩個靶標實現(xiàn)有效的敲低效率（圖 15 A）。為了評估這些細胞的增殖能力，進行了CCK-8和集落形成測定。結(jié)果表明，敲低EMX2OS顯著促進ccRCC細胞的增殖，而敲低LINC00944顯著抑制其增殖（圖  15 B、C）。此外，進行了Transwell檢測以研究EMX2OS和LINC00944對細胞遷移和侵襲的影響。敲低EMX2OS增強了細胞遷移和侵襲，而敲低LINC00944抑制了這些過程（圖  15 D、E;P <0.01對于所有比較）。

圖15

10、EMX2OS和LINC00944的下調(diào)影響ccRCC細胞的凋亡和細胞周期

傷口愈合試驗用于評估ccRCC細胞的遷移能力，顯示EMX2OS敲低后遷移能力增加，敲LINC00944后遷移能力降低（圖  16 A; 所有比較的P<0.001）。研究發(fā)現(xiàn)，敲低EMX2OS 可抑制腎透明細胞癌（ccRCC）細胞系的細胞凋亡，而敲低LINC00944則促進ccRCC細胞的細胞凋亡（圖16B）。具體來說，在EMX2OS敲低后，G0/G1期的ccRCC細胞減少，S期細胞的相應(yīng)增加。相反，敲低LINC00944導(dǎo)致G0/G1期ccRCC細胞增加，而S期細胞減少（圖 16 C）。

圖16

11、EMX2OS和LINC00944的下調(diào)增強了ccRCC的干性

探究了EMX2OS和LINC00944沉默后干性及其相關(guān)基因的變化。EMX2OS的下調(diào)上調(diào)了CD133、EPCAM和SOX2的mRNA和蛋白質(zhì)水平，并促進了球體形成（圖17A、B）。相反，LINC00944的下調(diào)下調(diào)了干性相關(guān)基因的表達，并抑制了球體形成（圖17A、B）。將EMX2OS和LINC00944的短發(fā)夾RNA（shRNAs）轉(zhuǎn)染到ccRCC類器官中（圖17C）。敲低EMX2OS促進了ccRCC類器官的生長，而沉默LINC00944則抑制了ccRCC類器官的生長（圖17D）。免疫熒光顯示，在沉默SRlncRNA后，類器官中KI67的表達發(fā)生了改變，這與在類器官生長中觀察到的變化一致（圖17E）。異種移植瘤模型顯示，sh-EMX2OS組的腫瘤大小和重量均顯著增加，而sh-LINC00944組則減?。▓D17F）。sh-EMX2OS組的肺轉(zhuǎn)移病灶更多，而sh-LINC00944組的病灶較少（圖 17G）。

圖17

總結(jié)：研究構(gòu)建了The first oneccRCC干性相關(guān)lncRNA特征集，可有效預(yù)測預(yù)后、免疫浸潤和藥物敏感性，其中EMX2OS和LINC00944通過調(diào)控細胞增殖、遷移等參與腫瘤進展，為ccRCC精準治療提供新靶點。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！